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都是qPCR，结果为何差距这么大？
点击次数：6384 发布时间：2023/3/25 10:43:49
qPCR的荧光标记方法分为以添加荧光基团核酸探针为主的荧光探针法，以绿色染料为主的荧光染料嵌合法。
利用不同化学原理设计的qPCR实验，
实验结果可能会产生不小的差距！
本期内容，我们一起来聊聊这两种常见的qPCR荧光标记方法有何不同，帮助大家选择更符合自身实验需求的方法。
荧光探针法
简单来说，应用该原理的荧光探针，是由荧光基团+DNA寡核苷酸+淬灭基团构成。
探针由5’端标记有荧光报告基团、目标基因特异性结合的寡核苷酸序列以及3’端标记有淬灭基团以及与组成。
自然状态下，探针完整，荧光报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，仪器不会检测到荧光信号。
当存在目标序列时，目标DNA变性解链，荧光探针特异性结合到目标基因处。引物也结合在目标基因上，Taq酶又名DNA聚合酶，能将核苷酸添加到引物中，引物开始延伸。
Taq酶还具有5’-3’核酸外切酶活性。当引物延伸至探针结合处，可将探针水解，使荧光报告基团和淬灭基团分离，进而被qPCR仪检测到荧光信号，荧光信号的强度与扩增得到的DNA的浓度成正比。
荧光信号被仪器检测并采集得到“扩增曲线”，通过荧光信号的强度反映出体系中双链DNA的浓度。
荧光探针有许多不同种类，以应对不同的实验需求，该方法特异性高，已经被广泛地应用于基因检测、病原体和病毒检测、疾病耐药基因筛查等领域。
德国MB支原体检测试剂盒
Venor®Gem qEP
应用荧光探针法对支原体DNA进行检测，准确率高，使用方便。
荧光染料嵌合法
该方法用到一种非特异性双链DNA荧光染料，被激发后，显示为绿色荧光。
该染料以一种非特异性方式，与双链DNA（dsDNA）双螺旋小沟区域相结合。游离的染料荧光信号微弱，在进行qPCR扩增生成dsDNA时，染料逐渐与dsDNA结合，荧光信号被很大程度放大，荧光信号的强度与扩增得到的dsDNA的浓度成正比。
荧光信号被仪器检测并采集得到“扩增曲线”，通过荧光信号的强度反映出体系中dsDNA的浓度。
德国MB支原体qPCR检测试剂盒，应用荧光探针法原理，对支原体DNA进行检测，具有特异性更强、灵敏度更高、可重复性更佳的特点。
支原体检测方面，通过欧洲药典和日本药典方法学检验。
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